1.前夜將磁珠及勻漿管洗凈置入75%乙醇中浸泡。早晨取出磁珠和勻漿管,自然晾干;也可放入烤箱中,速度較快。

　　2.裂解液配制：RIPA:PMSF=100:1,現(xiàn)配現(xiàn)用。置入4℃冰上。

　　3.抽蛋白：

　　適量組織加入裂解液中。

　　勻漿操作。

　　手工勻漿：將剪碎的組織倒入玻璃勻漿管中,再將剩余的1/3勻漿介質(zhì)或生理鹽水沖洗殘留在燒杯中的碎組織塊,一起倒入勻漿管中進(jìn)行勻漿,左手持勻漿管將下端插入盛有冰水混合物的器皿中,右手將搗桿垂直插入套管中,上下轉(zhuǎn)動(dòng)研磨數(shù)十次(6-8分鐘),充分研碎,使組織勻漿化。

　　機(jī)器勻漿：用JJ-2組織搗碎勻漿機(jī)上下研磨制成10%組織勻漿,也可用內(nèi)切式組織勻漿機(jī)制備(勻漿時(shí)間10秒/次,間隙30秒,連續(xù)3~5次,在冰水中進(jìn)行),皮膚、肌肉組織等可延長(zhǎng)勻漿時(shí)間。

　　超聲粉碎：用超聲粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎,可用超聲波發(fā)生器以振幅14微米超聲處理30秒使細(xì)胞破碎,也可用國(guó)產(chǎn)超聲波發(fā)生儀,用40安培,5秒/次,間隙10秒反復(fù)3-5次。

　　反復(fù)凍融：培養(yǎng)或者分離的細(xì)胞可以用以上的方法勻漿,也可以反復(fù)凍溶3次左右(即讓細(xì)胞加適量的低滲液或者雙蒸水放低溫冰箱中結(jié)冰,溶解,再結(jié)冰,再溶解,反復(fù)3次左右),但有部分酶活力會(huì)受影響。

　　將組織勻漿轉(zhuǎn)入1.5ml的EP管中(離心管)。12000r/min 4°C離心15min。

　　離心后EP管中液體分三層,提取中間無(wú)色液相,移入新的EP管中?？?80℃保存。

　　大多數(shù)蛋白樣品可通過(guò)比色測(cè)定法定量。在典型的蛋白測(cè)定中,化學(xué)試劑加入到蛋白樣品溶液里產(chǎn)生顏色變化,這一變化可由分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀檢測(cè),并與已知濃度的蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線作比較。如果樣品數(shù)量較多,可以同時(shí)使用兩種測(cè)定用酶標(biāo)儀自動(dòng)檢測(cè)。當(dāng)你選擇一種蛋白測(cè)定方法時(shí)需要考慮兩個(gè)因素：緩沖液的化學(xué)組成和檢測(cè)的蛋白量。